SOCIEDAD DE MICROSCOPIA DE ESPAÑA
Laboratorios destacados
La criomicroscopía electrónica (crioME) ha supuesto una revolución en la biología estructural, ya que se puede utilizar para determinar la estructura de proteínas o complejos macromoleculares en su estado nativo, incluso a resolución atómica, e identificar estados conformacionales de muy corta duración. Además, permite la determinación estructural de regiones celulares a alta resolución, gracias a técnicas de tomografía electrónica. La determinación de estructuras celulares o subcelulares a alta resolución (incluso menos de 10 Å) puede relacionarse directamente con eventos biológicos registrados por técnicas de microscopía lumínica. Estas técnicas que relacionan distintos tipos de microscopía (lumínica, electrónica de barrido o de transmisión) se llama microscopía correlativa y en los últimos años se han añadido técnicas criogénicas que permiten mantener la muestra a analizar en condiciones cercanas a las nativas.
Finalmente, otra avenida en el campo de la criomicroscopía electrónica es la posibilidad de llevar a cabo técnicas de difracción electrónica, que permiten el manejo de microcristales, y extraer información estructural a resolución atómica utilizando enfoques desarrollados para la difracción de rayos X y donde esta técnica no es capaz de alcanzar resultados, de compuestos biológicos y de complejos entre los dos (por ejemplo, en el caso de inhibidores orgánicos unidos a complejos macromoleculares de interés biológico).
El servicio de crioME del Centro Nacional de Biotecnología (CNB) http://www.cnb.csic.es/index.php/es/investigacion/servicios-cientificos/microscopia-crioelectronica) es pionero en España en ofrecer una serie de técnicas de crioME que pueden resultar útiles tanto a biólogos moleculares como a biólogos celulares, y lo hace no sólo gracias a una magnífica infraestructura sino también gracias a su magnífico personal (Figura 1). El servicio de crioME forma parte de dos iniciativas europeas de infraestructura en biología estructural (INSTRUCT-ERIC, https://instruct-eric.eu/) e iNEXT Discovery, https://inext-discovery.eu/network/inext-d/home).
Personal actual del servicio de crioME del CNB. De izquierda a derecha, Dra. Rocío Arranz (jefa del servicio), Dr. Javier Chichón, Dra. Teresa Bueno, Noelia Zamarreño, Dr. Javier Conesa, Jonathan Piccirillo, David Delgado, Dr. César Santiago (jefe del servicio de cristalografía macromolecular de rayos X del CNB y responsable de la infraestructura de difracción electrónica) y Javier Collado.
Dispositivos de vitrificación
El servicio cuenta con todo el instrumental de última generación necesario para la preparación de muestras congeladas a alta velocidad (vitrificadas) (Figura 2), que incluye tres dispositivos para la congelación ultrarrápida de soluciones acuosas o muestras de poco espesor (Leica CPC, Leica GP2 y FEI Vitrobot Mark IV) y un aparato de vitrificación en condiciones de alta presión para la vitrificación de muestras de mayor espesor (p.ej. tejidos), un ICE-high pressure freezing de Leica.
Microscopía electrónica de transmisión
Una vez preparadas las muestras el servicio dispone para su visualización y la eventual adquisición de imágenes, de dos criomicroscopios electrónicos de última generación (Figura 3), un JEOL CryoARM 300, de 300 kV (dotado de un detector directo de electrones Gatan K3 y un filtro de energía Omega) y un FEI Talos Arctica de 200 kV (dotado de un detector directo de electrones Falcon III). Estos dos aparatos son usados fundamentalmente para la adquisición, de manera automática, de un gran número de imágenes para el procesamiento las partículas (proteínas, complejos macromoleculares) que contienen las imágenes, de cara a obtener reconstrucciones tridimensionales a la más alta resolución posible, en muchos casos cercana a la resolución atómica. Los dos criomicroscopios electrónicos, pero fundamentalmente el primero, está preparado para llevar a cabo adquisiciones mediante la técnica de tomografía electrónica, que permite la reconstrucción tridimensional de especímenes pleiomórficos como células o estructuras subcelulares.
Además, para la caracterización previa de las muestras por técnicas estándar de tinción negativa, el servicio cuenta con un microscopio electrónico JEOL JEM 1400 de 120 kV.
Criomicroscopía correlativa
Una nueva avenida en la crioME incluye técnicas correlativas capaces de seguir eventos biológicos en células individuales mediante el uso criomicroscopía confocal y de moléculas fluorescentes, que pueden estudiarse posteriormente a alta resolución mediante la crioME más avanzada. El uso conjunto de estas técnicas se denomina criomicroscopía correlativa, y la infraestructura en su versión más sofisticada sólo se encuentra en un puñado de laboratorios en todo el mundo y uno de ellos es la instalación de crioME del CNB. La muestra vitrificada, a presión normal o alta presión, dependiendo del espesor de la muestra (Figura 4; 1) se visualiza con un miscroscopio confocal Zeiss LSM900 con detector Airyscan2 en condiciones criogénicas en busca del evento biológico a analizar, que puede ser rastreado mediante una etiqueta fluorescente ligada a una proteína que forma parte del problema biológico en estudio, y para la obtención de información funcional (Figura 4; 2). Una vez la información es recogida, su posición tridimensional (x,y,z) es registrada para el siguiente paso del proceso.
Este paso tan crucial se basa en el uso de un criomicroscopio electrónico de barrido (SEM) acoplado a un cañón iónico focalizado (FIB; en el caso de la instalación de crioME del CNB, un FIB-SEM Zeiss CrossBeam 550) (Figura 4; 3) que se emplea para aplicar dos métodos diferentes. El primero, proveyendo de información estructural tridimensional a nivel de orgánulo celular, se basa en la ablación iterativa de la superficie de interés con resolución nanométrica mediante el cañón de iones y la posterior obtención de imágenes de superficie con el microscopio de barrido, para finalmente fusionar todas las imágenes de la sección y generar una reconstrucción tridimensional de la muestra en estudio (Figura 4; 4). Alternativamente, cuando se requiere información de mayor resolución y dado que el grosor de las células eucariotas (aproximadamente 5-10 µm) no permite su visualización directa en el microscopio de transmisión, las muestras pueden ser reducidas a láminas de 0,3 µm de grosor que contienen el evento de interés utilizando el cañón iónico (Figura 4; 5). Completado el proceso, las muestras adelgazadas son transferidas al criomicroscopio electrónico para su posterior reconstrucción tridimensional mediante técnicas de tomografía electrónica (Figura 4; 6).
Microdifracción electrónica
Finalmente, el servicio de crioME dispone de la infraestructura para llevar a cabo difracción de electrones de cristales. Muchas veces, el proceso de formación de cristales tridimensionales (de compuesto orgánicos o biológicos) se paraliza una vez que se han formado microcristales (~1 µm), que por su pequeño tamaño no son analizables por las técnicas de difracción de rayos X. Sí que pueden serlo utilizando electrones, que interaccionan mucho más con la materia que los rayos X (104 veces más) y por lo tanto no requieren de una gran cantidad de material ordenado. El microscopio electrónico puede ser utilizado como un difractómetro de electrones y los cristales y espectros de difracción tratados por procedimientos muy parecidos al flujo de trabajo que se utiliza con los rayos X. El servicio de CrioME está preparado, gracias a la adquisición del hardware y software adecuados (Figura 5), para desarrollar difracción electrónica de cristales de moléculas orgánicas y biológicas, lo que en el primer caso abre el servicio a la comunidad de químicos orgánicos del país.
A.- Cristal de paracetamol sobre rejilla de carbono Lacey, preparado para la toma de datos.
B.- Patrón de difracción de electrones a ~ 0.7 Å
C.- Estructura resuelta a 0.8 Å con la molécula representada en forma de bola y palo. Los átomos de carbono se muestran en negro, el nitrógeno en azul y el oxígeno en rojo.